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番茄严重皱病病毒(ToSRV)和番茄褪绿病毒(ToCV)是两种由白蛉传播的植物病毒，主要分布在亚热带为主的番茄产区。
ToSRV通过烟粉虱复合体的隐蔽种中东-小亚细亚1 (MEAM1，以前的生物型B)、新世界2和地中海(MED，以前的生物型Q)的优势白蝇品种以持续循环的方式传播。
ToCV通过MEAM1、MED、新世界1 (NW1，以前的生物型a)和NW2以及abutilontrialeurodes和T. vaporariorum以半持久的方式传播。
在番茄作物中，番茄褐色皱果病毒 (ToSRV)和番茄褪绿病毒 (ToCV)的单感染和联合感染非常常见。
本研究的目的是分析ToSRV和ToCV在圣克拉拉(Santa Clara)和卡达(Kada)番茄植株上的相互作用。
基于此，我们设计了两组独立实验，分别在出芽后15、30和45 d，每株接种30株毒力强的烟粉虱，同时比较了接种ToSRV、ToCV、ToSRV ToCV和健康对照。
试验植物以Kada和Santa Clara两个品种的番茄幼苗为试验材料，在含有Plantmax基质的培养皿中进行培育。
第一个真叶期的幼苗被移植到含有相同基质的花盆中，每个花盆一株幼苗。
******虱群在温室防虫笼中的甘蓝植株上饲养无病毒烟粉虱MEAM1菌落。
利用引物对Bem 23f5 ' -CGGAGCTTGCGCCTTAGTC-3 '和Bem 23r5 ' -CGGCTTTATCATAGCTCTCGT-3 '进行PCR鉴定。
病毒分离株,维护和接种利用PAL1v1978/PAR1c496和ToC5/ToC6引物对ToSRV和ToCV扩增子进行PCR和RT -PCR鉴定，随后对扩增子进行核苷酸测序。
进一步将这些核苷酸序列与GenBank中其他ToSRV和ToCV分离株的相应核苷酸序列进行比较。
两种病毒分离株分别保存在温室防虫笼内的番茄植株中，用烟粉虱MEAM1成虫接种番茄植株。
无病毒昆虫被限制活动范围，仅限在ToSRV或tocv感染的番茄叶片上活动。
昆虫及植株共同放置在单个50 ml的聚丙烯离心管中，获得接触期(AAP)为24小时，每个管中平均放置200只成虫。
用同样的方法将带病毒的白蝇转移到健康的番茄植株上接种病毒。
番茄植株ToSRV与ToCV互作效应评价我们一共进行了两个独立的实验。
在第一次试验中，卡达和圣克拉拉番茄植株在出芽后30天和45天，每株接种30株具有毒力的烟粉虱MEAM1成虫。
接种准入期(IAP) 5 d后，对所有植株喷施杀虫剂(盐酸卡塔普，2.5 mg/L)。
将接种ToSRV的植株、接种ToCV的植株、接种ToSRV ToCV的植株和健康植株(对照)各6株进行比较。
每种处理的植物被放置在单独的防虫笼中，以地上部分的鲜重和干重为基础，以80 DAE进行植株发育评估。
第二次试验的处理方法相同，只是只使用加田番茄植株，并在15和30 DAE时接种病毒。
我们决定在第二次试验中只分析一个品种是因为在第一次试验中它们之间没有显著性差异，选择评估15个DAE而不是45个DAE，是为了验证早期接种对植物发育的影响。
试验中使用的品种对ToSRV和ToCV都没有抗性。
病毒量化接种后30 d，采用qPCR和RT-qPCR方法分别对所有植株进行ToSRV和ToCV滴度测定。
使用PureLink病毒RNA/DNA迷你试剂盒从每株植物的底部，中部和上部的叶子中收集的六个叶盘中提取总DNA/RNA。
为了建立病毒浓度标准曲线，首先用引物ToC5/ToC6扩增提取的ToCV RNA，扩增出包含热休克蛋白70同源基因(Hsp70h)的约480 bp片段。
对于ToSRV，用引物PAL1v1978/PAR1c496扩增了总DNA，扩增了一个约1.1 kb的片段，包括复制酶(rep)基因的5 '区、整个基因间区和外壳蛋白(cp)基因的5 '区。
两种病毒的扩增子分别克隆在pGEM-T Easy载体上，使用QIAGEN质粒迷你准备试剂盒从选定的菌落中提取质粒。
为每种病毒选择了三个克隆并对其进行测序，以进行后续分析，以确认扩增子插入质粒和各自病毒的辨别。
利用NanoDrop对含有ToSRV插入物和ToCV插入物的两个质粒的DNA模板进行定量，建立病毒浓度标准曲线。
在编码Hsp70h蛋白的基因(tocv - f5′-GACCGAAGTGACACCAACCC-3′和tocv - r5′-TGGGACCGAGTACATTCCAAC-3′)对应的区域设计tocv特异性引物进行病毒RNA定量。
为了定量病毒DNA，在基因间区设计tosrv特异性引物(tosrv - f5 ' -GCAACCGCCTCTAGCACTTC-3 '和tosrv - r5 ' -GACCTGGTCTCCCCAACAAGG-3 ')。
两对引物扩增出140 bp的片段。
RT-qPCR和qPCR在7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)中进行。
使用GoTaq qPCR Master Mix 12.5μL，含提取DNA或RNA的1.25μL(200 ngμ/L)， 6.25μL 2×GoTaq qPCR Master Mix，正向引物和反向引物各0.62μL(10μm)， 0.19μL CXR参比染料，0.25μL GoScript RT Mix用于一步RT-qPCR无核酸酶水完成反应(用于RNA RT-qPCR)。
阴性对照组使用水和健康番茄植株的DNA/RNA作为原始材料重复上述步骤，每个qPCR在每个植株上重复运行。
通过对随机选择的扩增子进行核苷酸测序，证实了目标扩增，扩增后进行熔化曲线分析。
ToSRV和ToCV的特性克隆的ToSRV扩增子与GenBank中ToSRV分离株的核苷酸序列完全一致，克隆的ToCV扩增子与GenBank中ToCV分离株核苷酸序列的一致性为96% ~ 99%。
番茄植株的ToSRV和ToCV滴度在两个发育阶段接种烟粉虱MEAM1的Kada和Santa Clara番茄进行了两项独立检测，评估了ToSRV和ToCV在单感染和共感染中的滴度。
与接种时间(15、30和45 DAE)和品种无关，与单独感染begomvirus的番茄相比，两种试验均未观察到ToCV共感染番茄的ToSRV滴度有明显的增效或拮抗作用。
共接种植株的begomavirus滴度略高于单独接种每种病毒的植株;然而，没有观察到显著差异。
对于ToCV，共感染ToSRV的植株和仅感染ToCV的植株的边缘病毒浓度同样没有显著差异。
植物发育在30或45 DAE接种ToSRV、ToCV或ToSRV ToCV的Kada和Santa Clara番茄植株鲜重和干重与健康(对照)番茄植株相比有显著差异，然而，单、双侵染植株之间并无差异。
经30 DAE处理，ToSRV、ToCV或ToSRV ToCV的圣克拉拉番茄植株干重分别比对照降低25%、36%和33%。Kada植株干重分别减轻39%、48%和40%。
接种45 DAE的圣克拉拉番茄植株干重分别减少18%、15%和31%，卡达番茄植株干重分别减少13%、21%和38%。
第二次测定也得到了类似的结果。15 DAE时，ToSRV、ToCV和ToSRV ToCV侵染的加田番茄植株干重分别比对照降低40%、43%和37%。
接种30 DAE的植株干重分别减少35%、38%和37%。
大多数协同作用发生在不相关的植物病毒感染同一宿主细胞时，然而，有一些韧皮部限制病毒和实质细胞复制病毒之间的协同相互作用的例子，如莴苣感染黄病毒(LIYV)和马铃薯花叶病毒(TuMV)，马铃薯羽毛斑驳病毒(SPFMV)和马铃薯褪绿矮病毒(SPCSV)之间的共感染。
本研究提供了一个DNA (ToSRV)和RNA (ToCV)病毒之间缺乏显著协同相互作用的例子，它们感染番茄植株的不同细胞。
虽然ToSRV在与ToCV共感染的植株中具有较高的滴度，但与分别感染每种病毒的植株相比，Kada和Santa Clara植株的这种增加并不显著，也不会导致植株发育进一步降低。
单独侵染和共侵染的番茄植株的ToCV滴度无显著差异，对于DNA和RNA病毒之间的相互作用，我们得到了类似的结果。
在大多数情况下，这种相互作用与明显的症状无关，与单一感染相比，协同病毒滴度的增加与crinivirus SPCSV滴度的相应降低相关。
本研究未发现病毒积累与植物发育之间存在相关性。
与健康番茄植株相比，ToSRV、ToCV或ToSRV ToCV感染植株鲜重和干重显著降低，但这些性状在感染植株间无显著差异。
在第一个实验中，Kada比Santa Clara受影响更大。
对于感染ToSRV ToCV的番茄植株，较年轻接种植株的发育受到的影响大于较老接种植株，这可能对产量的影响比例更大。
在两个独立的实验中，在移植后15天接种了这两种病毒的杂交马里亚纳番茄植株的产量比健康植株减少了45.6%和54.5%。
移栽75 d后接种的植株，仅一次试验产量下降约6.3%。
我们对18个番茄基因型对ToCV致黄病的耐受性进行了分析，结果表明，与健康植株相比，各基因型番茄地上部干重和果实产量的下降幅度分别为1.4% ~ 67.6%和0.1% ~ 51.8%。
在双重感染的番茄植株中，ToSRV和ToCV的传播率似乎不受影响。
烟粉虱MEAM1侵染单一或共侵染番茄植株时，ToCV和ToSRV的传播率相同。
在番茄植株中，ToSRV和ToCV的系统入侵动力学以及潜伏期和潜伏期也是如此。
很难解释在番茄植株中DNA (ToSRV)和RNA (ToCV)病毒之间没有显著的协同相互作用，几个变量可能导致两种病毒(如病毒分离物)之间发生协同相互作用。
另一方面，番茄植株中ToSRV和ToCV之间的一些不同特征可能解释了协同相互作用的缺失。
ToCV在细胞质中复制，ToSRV则在细胞核中复制。
ToSRV在番茄植株中引起的症状主要出现在上部叶片，而ToCV症状出现在老叶中，很少到达幼叶。
虽然ToSRV和ToCV在番茄植株中没有发现显著的协同效应，但无论是单一感染还是混合感染，两种病毒均显著影响植株的发育，从而导致产量的数量和质量下降。
因此，应采用由ToSRV引起的金花叶病和由ToCV引起的番茄变黄的管理方案，以尽量减少对番茄作物的损害。
根据两项独立试验，与单独感染相比，ToSRV和ToCV共感染对病毒滴度和植物发育没有显著影响。
感染ToSRV、ToCV和同时感染的番茄植株干重差异不显著,与健康植株相比，感染ToSRV、ToCV和ToSRV ToCV的圣克拉拉番茄植株的干重平均分别降低了21.5%、25.5%和32%，卡达番茄植株的干重平均分别降低了31.7%、37.5%和38%。
在分析了采集的150株番茄叶片样本中病毒的发病率后，我们可以肯定地说，番茄可以自然感染一种或两种病毒——48%的植株双染，32%和20%的植株仅感染ToCV或ToSRV。
感染ToSRV的番茄植株表现为绿斑、脉间褪绿、叶片卷曲、上部叶片皱褶和发育迟缓，而感染ToCV的番茄植株则表现为脉间褪绿区，特别是在老叶片上，变脆，可能有坏死斑点和向上弯曲的边缘。
双重或多重感染在植物病毒中很常见，并可能导致协同作用，增加一种或两种病毒的复制。
相互作用还可能影响寄主范围、媒介传播率、一种或两种病毒的细胞趋向性，以及植物发育和产量的定量和定性降低。
参考文献[1]高文征，《番茄褪绿病毒病鉴定方法研究及抗病基因初步定位》
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[3]马瑞丽，《番茄褪绿病毒RT-PCR检测方法的优化及环保酵素对番茄褪绿病毒病抗性影响的研究》
[4]龚猛，《秋延迟番茄皱叶病的发生与防治》
