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今天推送的文章是2023年6月发表在ACS Catalysis上的“Rational Design of the Substrate Tunnel of β-Ketothiolase Reveals a Local Cationic Domain Modulated Rule that Improves the Efficiency of Claisen Condensation”，通讯作者是来自江南大学的邓禹教授和周胜虎副研究员。
克莱森酯缩合反应是形成碳-碳键的重要反应，在自然界中，硫酶超家族催化引物酰基辅酶a (Cn-CoA)的Cα与扩展剂乙酰辅酶A的Cα之间的Claisen缩合，这是许多生物合成途径的第一步(图1)。该反应将碳链延长了两个碳单元，生成C(n 2)-CoA产物，该产物可以作为下一个Claisen缩合反应的引物，进一步延长碳链。β-酮硫解酶是硫解酶超家族中的 I 型硫解酶，能够容纳中间酰基链底物合成长链脂肪族化合物。以乙酰辅酶 A 和不同的酰基辅酶 A 为前体，β-酮硫解酶是生物合成各种化学物质的重要工具。工程化 β-酮硫解酶提高性能对生物化学合成具有重要意义。
β-酮硫解酶有一个大的底物通道，可以容纳不同碳链长度的酰基辅酶 A。以往的研究主要集中在改变 β-酮硫解酶的底物选择性以产生线型或支链化合物。通过对不同 β-酮硫解酶底物选择性的分析，发现底物通道的大小是影响底物选择性的主要因素。此外，底物通道也与酶活性密切相关。虽然可以合成多种产物，但 β-酮硫解酶的低酶活性限制了产物的产率。然而，对于β-酮硫解酶的底物通道是如何影响催化机制进而影响酶活性知之甚少。
β-酮硫解酶的活性中心埋藏在底物通道中，容纳了一个保守的 Cys-His-Cys 催化三联体。因此，改造底物通道可能会影响克莱森酯缩合反应的形成过程，影响酶的活性。然而，以往在底物通道工程方面的尝试并没有普遍适用于提高其他 β-酮硫解酶的酶活性的方法。因此，探索一种通用的底物通道调控机制，有助于建立一种可靠、通用的 β-酮硫解酶工程方法。
在作者之前的研究中，Thermobifida fuscaβ-酮硫酶Tfu_0875对二羧酸的生物合成具有优异的催化性能。本研究证明了Tfu_0875具有很高的热稳定性和酶活性。为了合理设计Tfu_0875的底物通道，进一步提高酶活性，采用深度学习方法(DLKcat)基于高分辨率三维蛋白结构预测kcat值。通过比较野生型和突变型Tfu_0875的结构差异，建立了一个局部阳离子结构域调制规则(LCDMR)，该规则可显著提高β-酮硫酶的催化性能。LCDMR可用于提高其他β-酮硫酶的酶活性，在生物合成反应中具有促进碳-碳键形成的巨大潜力。
β-酮硫醇酶Tfu_0875的热稳定性表征
首先比较了 Tfu _ 0875和三种 β-酮硫解酶的催化性质。结果显示，Tfu _ 0875在15-65 °C 的温度范围内保持高酶活性，并且在37 °C 时最高酶活性达到1.50 μmol/min/mg (图2A)。但是，当温度高于50 °C 时，其余3种 β-酮硫解酶的活性都降低了。此外，Tfu _ 0875的蛋白变性温度(Tm = 81.06 °C)高于 PcaF (Tm = 65.86 °C) ，BktB (Tm = 67.27 °C)和 PhaA (Tm = 67.13 °C) (图2B)。此外，Tfu _ 0875表现出最高的热稳定性，在37 °C 热处理8天后保留79.7% 的相对酶活性，显著优于其他 β-酮硫解酶(图2C)。
Tfu _ 0875的晶体结构及催化机理
Tfu _ 0875由于缺乏高分辨率的晶体结构，以及催化机制不明确，阻碍了合理的蛋白质工程来改善酶的性质。一般来说，β-酮硫醇酶超家族具有二聚体，四聚体或更高的聚合度，使得难以获得三维结构。Tfu _ 0875与同源四聚体 β-酮硫解酶 PcaF (PDB ID: 6PCA)有56.4% 的序列同一性。因此，对 Tfu _ 0875(PDB ID: 7VTR)的晶体结构进行了分子置换，其分辨率为1.93 Å。在晶体分析过程中，不对称单元含有两个相同的 Tfu _ 0875单体，形成二聚体，二聚体结合形成四聚体。这种四聚体结构通过四个单体的扩展环结构域之间的相互作用而稳定(图3A)。单体的结构具有 I 型硫解酶的典型折叠结构，由 N-结构域(残基1-119和249-269) ，环结构域(残基120-248)和 C-结构域构成(残基270-391; 图3B)。Tfu _ 0875的 N-结构域和 C-结构域形成了其他硫醇酶超家族中的 βαβαβαβ 三明治拓扑结构。
β-酮硫解酶的活性氨基酸残基高度保守，尤其是 Cys-His-Cys 催化三联体。序列比对和丙氨酸扫描(图3C)证实了 Cys90-His348-Cys378是 Tfu _ 0875的催化三联体。这些残基埋藏在蛋白质结构中，底物必须通过 Tfu _ 0875的底物通道才能进入催化三联体进行催化。使用 CAVER3.0分析了 Tfu _ 0875的结构以揭示其基底通道(图3D)。Tfu _ 0875的底物通道主要由三个区域构建: 阳离子结构域，腺嘌呤结合口袋和泛氨酸环，分别结合底物酰基辅酶 A 的三个不同部分(3D)。底物通道的变化可能对酶活性有很大的影响，因此通过合理地设计底物通道以提高酶活性。
为了鉴定可能与底物分子相互作用的氨基酸残基，使用AutoDock Vina进行分子对接以获得酶-底物复合物的模型。Tfu_0875的活性结构域含有氧阴离子空穴(OAHs)，通过在去质子化的氧原子或醇氧化合物上带负电荷来维持过渡态。Tfu_0875利用两个OAHs稳定底物的过渡态，与其他硫酶催化Claisen缩合反应一样。OAH1由一个H2O分子和稳定烯酸酯的残基Asn315和His348组成(图3E)，而OAH2由Cys90-Ser92和Cys378-Gly380的主链NH基团组成 (图3E)。其中，催化三联体中的His348作为锚点结合底物，氧阴离子空穴中的Cys90和Cys378作为乙酰基受体参与电子转移的催化中心。整个催化过程包括三个步骤:第一步，Cys90亲核攻击酰基辅酶a底物，生成能够进一步攻击OAH1中的Cys90-酰基共价中间体激活Cys378，然后Cys90-酰基共价中间体转移到OAH2; 激活后的Cys378作为亲核碱基攻击OAH1中的乙酰辅酶a，生成乙酰辅酶a烯酸酯;第三，乙酰-COA烯醇酸酯的α-碳离子攻击酰基- Cys90的羰基碳，形成新的碳-碳键 (图3F)。
基于深度学习的Tfu_0875底物通道合理工程
硫解酶的底物通道通常较长，缺乏弹性，不利于底物催化，影响克莱森酯缩合反应的效率。Tfu _0875的催化三联体埋藏在底物通道中(图4A) ，因此这些通道位点的突变有可能在不破坏活性位点结构的前提下产生活性提高的突变体。因此选择覆盖 Tfu _0875底物通道三个区域的乙酰辅酶 A 5埃范围内的氨基酸残基作为突变靶点。总体而言，除了催化三联体外，还鉴定出26个氨基酸残基(图4A)。对这些氨基酸残基进行丙氨酸扫描突变，以鉴定可能影响酶活性的氨基酸残基。与野生型 Tfu _ 0875(WT-Tfu _ 0875)相比，相对酶活性改变 > 10% 的突变体被认为影响催化，并选择21个候选氨基酸残基进行进一步分析。其中，突变体 M120A 和 L350A 的相对酶活性分别比 WT-Tfu _ 0875提高了85% 和12% ，但其余19个突变体的相对酶活性下降(图4B)。
为了避免传统的饱和突变耗时、费力的问题。本研究引入了 DLKcat。DLkcat 是通过结合图形神经网络(GNN)和卷积神经网络(CNN)来学习底物结构和蛋白质序列，预测周转数(kcat)和识别关键氨基酸残基而开发的。对 Tfu _0875全部21个氨基酸残基进行了虚拟饱和诱变。所有候选基因的氨基酸序列和乙酰辅酶 A 的 SMILES (SMILES)被 DLKcat 用作预测 kcat (图4C)。产生了具有预测的 kcat 值高于 WT-Tfu _ 0875的突变体，并验证了它们的相对酶活性(图4D)。在这些突变体中，与 WT-Tfu _ 0875相比，阳离子结构域，Pantetheine环和腺嘌呤结合口袋中的突变 L163H，N249W 和 E221G 活性分别增加了313,212和152%。阳离子区域和Pantetheine环中的突变涉及氮杂环，组氨酸(His)和色氨酸(Trp) ，这可能扩大了阳离子区域和Pantetheine环在底物通道中的空间。最后，基于获得的阳性突变体(图4D) ，使用 GRAISM (贪婪累积迭代位点特异性诱变)策略来迭代突变 Tfu _ 0875L163H，试图进一步增加酶活性。然而，第二轮突变体的相对酶活性均低于 Tfu _ 0875L163H，因此最佳突变体为 Tfu _ 0875L163H。
作者分析了酶活性增加 > 50% 的突变体的底物通道结构。Tfu _ 0875的腺嘌呤结合口袋主要涉及氨基酸残基 E217，E221，T222，L230和 I240，突变后空间位阻均降低(E217L、E221G、T222D、L230C和I240D)。突变体残基侧链的体积减小为底物的腺嘌呤结构保留了更大的空间(图5A)。同时，发现 E221/T222与底物的腺嘌呤结构之间的三个氢键在突变为 E221G/T222D 后减少为一个，这导致底物固定作用力的减少(图5A)。增加空间或减少周围力可能促进腺嘌呤环结构的自由摆动，从而容易与活性中心残基结合。此外，Tfu _ 0875的 Pantetheine 环在包括中性氨基酸残基 M120，G147和 N249的桶状三级结构中占据疏水通道，其控制泛酸脂肪链的延伸。突变 M120A，G147V 和 N249W 增强了长脂肪酰基链的疏水环境，从而增加了酶活性(图5B)。底物通道的阳离子区主要参与碳碳键形成过程中底物的锚定和稳定。L163H 和 F318H 的咪唑基团有利于产生氢键以稳定底物，可能促进催化(图5C)。总体而言，作者推测 Tfu _ 0875的酶活性增加主要是由于减少腺嘌呤结合口袋中的空间位阻，增加Pantetheine 环的疏水性和增加阳离子区对底物的稳定作用。
Tfu_0875突变体三个结构域的上述结构变化可能应用于其他β-酮硫酶以增强酶活性。其中，L163H位于乙酰辅酶a的乙酰基附近，在突变体中表现出最高的酶活性。OAH1由H2O、Asn315和His348组成，其中Asn315和H348可以形成氢键，His348作为氢键供体帮助稳定底物(图3E)。L163H的咪唑基团比His348的咪唑基团更接近乙酰辅酶a的Cα原子(图5D)，因此也可能发挥与His348相同的作用，作为氢键供体，帮助锚定底物，使其更容易被扩展剂攻击。同时，作者还发现Tfu_0875L163H的G147可以与L163H形成氢键，这与WT-Tfu_0875中的H348和N315 (OAH1)相同。因此，作者推测新的OHA是由G147、L163H和周围的H2O生成的(图5E)。作为验证，作者检测了Tfu_0875H348A和Tfu_0875L163H/H348A的相对酶活性，Tfu_0875L163H/H348A的相对酶活性比Tfu_0875H348A高1.79倍(图5F)，这表明L163H与His348一样起到了底物氢键供体的作用(图5E)。由于OAH1与OAH2具有稳定四面体中间体的功能，因此推测新形成的OAH也可以参与稳定四面体中间体(图3F和5G)。
为了准确阐明Tfu_0875L163H增强酶活性的机制，对WT-Tfu_0875和Tfu_0875L163H进行了分子动力学(MD)模拟。经过200 ns的MD模拟，通过计算均方根偏差(RMSD)，探究WT-Tfu_0875/Tfu_0875L163H-乙酰辅酶a配合物的稳定性。在属于Tfu_0875L163H环域的阳离子环附近的环区(残基121-156)显示出较高的均方根波动(RMSF)值，表明比WT-Tfu_0875具有更大的灵活性(图5H)。更灵活的环区可以为底物提供更广阔的反应空间(4.9 vs 6.5 Å)，有利于扩展剂攻击引物(图5I)。此外计算了在整个MD过程中乙酰辅酶a和Tfu_0875L163H之间产生的氢键数。结果表明，Tfu_0875L163H生成的氢键数明显高于WT-Tfu_0875(图5J)，说明Tfu_0875L163H与乙酰辅酶a的相互作用更强，可以快速锚定乙酰辅酶a，间接缩短反应时间。此外，当L163变为H163时，阳离子结构域的体积从69.18增大到81.15 Å3(图5K)。上述结果表明，阳离子结构域的体积与增强的酶活性之间存在明显的相关性。具体来说，较大的阳离子结构域与较高水平的酶活性相关(图5L)。这种变化的主要原因可能是 His具有较大的刚性咪唑基团，这增加了阳离子域内的空间，促进了催化动态过程中底物的接触。
L163位于“三明治拓扑结构”中α5区域与loop区域的交界处。根据上述分析，作者建立了LCDMR。具体来说，在“三明治拓扑结构”α5区和loop区交界的非保守残基突变His可以通过(1)增加阳离子结构域的体积，为底物提供更宽的反应空间;(2)增加周围残基与底物的氢键相互作用，加速Claisen缩合反应;(3)锚定底物，稳定四面体中间体，从而显著提高酶的活性。
LCDMR 在其它 β-酮硫解酶中的应用
由于不同底物通道结构域的突变可以显著提高酶的活性(图4D)，作者推测同样的效果是否可以推广到其他β-酮硫解酶。基于高活性 Tfu _ 0875突变体，通过序列和结构比对，对β-酮硫解酶 PcaF，BktB 和 PhaA 的相应氨基酸残基构建突变。与野生型β-酮硫酶相比，经LCDMR处理后，PcaFM163H、BktBM172H和PhaAM157H的酶活性分别提高到1.37倍、1.21倍和1.54倍(图6A)。然而，在对腺嘌呤结合口袋底物通道和Pantetheine环进行修饰后，PcaF、PhaA和BktB的大部分相应突变体的酶活性降低(图6A)。这表明LCDMR修饰阳离子结构域底物通道的策略可以普遍应用于其他β-酮硫酶，但底物通道的其他部分的修饰还需要进一步探索。
此外，作者还对 PcaF，BktB，PhaA 及其 LCDMR 修饰的突变体 PcaFM163H，BktBM172H 和 PhaAM157H 进行了 MD 分析。结果表明，修饰的突变体与底物乙酰辅酶 A 之间产生的氢键数量高于 β-酮硫解酶(图6B)。此外，LCDMR 修饰的突变体的阳离子结构域的体积大于野生型 β-酮硫解酶的体积，与基于 LCDMR 的预测一致。作者还发现突变后His的咪唑基团可以作为氢键供体，与PcaF、BktB和PhaA的活性氨基酸残基H356、H364和H349所发挥的作用相同(图6C，5E 和3E)。PcaFM163H/H356A，BktBM172H/H364A 和 PhaAM157H/H349A 的相对酶活性高于 PcaFH356A，BktBH364A 和 PhaAH349A (图6D) ，表明 M163H，M172H 和 M157H 在底物上起锚定作用，与活性氨基酸残基 H356，H364和 H349的作用相同。总体而言，对不同 β-酮硫解酶结构变化的 MD 分析表明，LCDMR 可以增强酶与底物之间的相互作用。
热稳定性分析表明，Tfu _ 0875L163H，PcaFM163H 和 PhaAM157H 的热稳定性降低，而 BktBM172H 的热稳定性与其野生型酶差异不大(图6E)。其中，Tfu _ 0875L163H 的热稳定性最高，在37 °C 热处理2天后仍保持38.2% 的相对酶活性。此外，Tfu _ 0875L163H 表现出比 PcaFM163H (Tm = 59.57 ° C) ，BktBM172H (Tm = 66.88 ° C)和 PhaAM157H (Tm = 59.37 ° C; 图6F)更高的蛋白质变性温度(Tm = 80.96 ° C)。然而，与野生型酶相比，LCDMR 修饰的 β-酮硫解酶的 Tm值随着酶活性的增加而降低(图2B 和6F)。为了准确评估野生型酶及其阳离子结构域突变体的催化特性，对动力学进行了评估。结果表明，所有阳离子区突变体的 kcat 值均高于野生型 β-酮硫解酶，其中 Tfu _ 0875L163H 的kcat值最高，是 WT-Tfu _ 0875的1.81倍。最后，动力学参数分析表明，Tfu _ 0875L163H 具有最高的催化活性(kcat/KM= 0.12 min-1mM-1)。因此，通过 LCDMR 将 Leu 或 Met 突变为 His 可以显著提高 β-酮硫解酶的活性，但是这些突变体的稳定性也存在不同程度地降低。
本研究采用基于 DLKcat 的合理工程方法，确定了高热稳定性 β-酮硫解酶 Tfu _ 0875的晶体结构，重点研究了其底物通道结构对酶活性的影响。使用 DLKcat 策略合理预测关键氨基酸残基，获得了酶活性增加了313% 的突变体 Tfu _0875L163H。通过对底物通道结构变化的比较，建立了一种能够指导合理设计底物通道阳离子结构域以提高酶活性的 LCDMR 模型。LCDMR 可以增加阳离子结构域的体积，提高底物和中间体的稳定性。为提高硫解酶超家族成员的酶活性提供了一个新的视角。
END
DOI：10.1021/acscatal.3c01426
