干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌一样吗？干酪乳杆菌十分具有价值

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副干酪乳酪杆菌作为乳杆菌科中具应用价值的菌种，是干酪乳酪杆菌和鼠李糖乳酪杆菌的近缘物种。

副干酪乳酪杆菌是国家卫生健康委员会发布的可用于食品的菌种之一，其常用来制备益生菌和发酵乳制品制剂。

然而，副干酪乳酪杆菌的系统命名和分类一直存在争议，特别是随着分类学技术的进步，该物种的模式株、系统分类和命名几经变迁。

1989年Collins等通过DNA-DNA杂交分析发现干酪乳杆菌中存在大量与模式菌株ATCC 393T同源性较低而菌株间同源性较高的菌株，因此建议干酪乳杆菌阿拉伯糖亚种、干酪乳杆菌假植物亚种、干酪乳杆菌坚韧亚种（Lactobacillus casei subsp. tolerans）以及大部分的干酪乳杆菌干酪亚种（Lactobacillus casei subsp. casei）划分为一个新的独立菌种即副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。

2020年副干酪乳杆菌更名为副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei），其模式菌株为ATCC 25302T，并保留了副干酪乳酪杆菌副干酪亚种（L. paracasei subsp. paracasei）和副干酪乳酪杆菌坚韧亚种（L. paracasei subsp. tolerans）2个亚种。

干酪乳杆菌Zhang其具有较强耐人工胃液、胆盐消化、免疫调节、抗氧化等益生功能。

2008年，本研究团队经生理生化鉴定和16S rDNA序列分析将Zhang的分类学地位鉴定为干酪乳杆菌。

干酪乳杆菌与其近缘物种间的亲缘关系错综复杂，基于传统的分类学方法和16S rDNA序列很难从种水平上进行区分。

本研究团队于2010年完成了Zhang全基因组测序，其是我国第1株完成全基因组测序的乳酸菌菌株，经进一步比较基因组学分析确认其的分类学地位为副干酪乳酪杆菌。

由于副干酪乳酪杆菌分类学地位的变迁和更新，Zhang的分类学地位需进一步确认。

此外，目前尚无关于该菌株耐药基因、致病性基因和环境抗性基因的研究，限制了其进一步开发和应用。

基于此，本研究利用比较基因组学方法解析Zhang的分类学地位和遗传背景，评估Zhang的耐药基因、致病性基因和环境抗性基因特征，揭示其基因组上携带的细菌素基因簇及潜在益生基因，旨在为菌株进一步开发及产业化提供数据参考。

截至2023年3月9日，采用NCBI-genome-download软件将NCBI（National Coalition Building Institute， https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）Refseq数据库中318株副干酪乳酪杆菌基因组完成图全部下载完成。

本研究团队前期已完成Zhang连续传代过程遗传稳定性的研究（已接收，未见刊），对第0，25，50，75，100代（每代3组平行）共15株菌进行了基因组测序和组装工作。

采用李伟程的方法，统计所有副干酪乳酪杆菌的基因组大小、GC含量以及蛋白质编码区（Coding sequence， CDS）。

本研究使用blastall软件将Zhang与GTDB数据库（http://gtdbecogenomic. org/）进行比对，e值小于e×10-10。

使用fastANI软件计算335株副干酪乳酪杆菌的平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity， ANI）值，比对片段长度设置为1 000。

使用prokka软件对菌株进行注释，通过Roary软件分析得到的核心基因序列，采用TreeBeST软件（http://www.mybiosoftware.com/treebest/）基于邻接法（Neighbor-joining， NJ）进行系统发育树构建，自举值为1 000。

通过iTol在线软件（https://itol.embl.de/）进行系统发育树可视化。

本研究以副干酪乳酪杆菌ATCC 334的全基因组完成图序列（GCF_000014525.1）作为参考基因组，使用Snippy软件（V4.6.0）中snippy-multi组件计算副干酪乳酪杆菌群体的核心SNP（Core-SNP）。

采用TreeBeST软件（http://www.mybiosoftware.com/treebest/）中的邻接法进行系统发育树构建，自举值为200。

在iTol在线软件（https://itol.embl.de/）中进行系统发育树可视化。

将Zhang基因组序列分别上传至在线注释CARD数据库（http://card.mcmaster.ca/，采用RGI5.1.0软件中的Perfect和Strict算法为筛选标准）、ResFinder数据库（https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder-4.1/），序列相似性>90%，序列覆盖度>60%、VFDB数据库（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm/），序列相似性>90%，序列覆盖度>60%和VirulenceFinder数据库（https://cge.food.dtu.dk/services/Virulence Finder/），序列相似性>90%，序列覆盖度>60%进行注释耐药基因、致病性基因和环境抗性基因。

以副干酪乳酪杆菌ATCC 334为参考序列，使用Mauve软件分析ATCC 334T、Zhang和PC-01之间的共线性关系。

利用BAGEL4在线数据库（http://bagel4.molgenrug.nl/index.php），对Zhang中核糖体合成、翻译后修饰肽和细菌素产生基因簇进行注释。

参照刘旭等和吴琼等的方法利用Prokka软件对菌株基因组进行基因预测后，挖掘菌株潜在益生基因。

本研究团队前期已完成Zhang的基因组测序和组装，发现Zhang包含1条染色体和1个质粒，其基因组大小为2.90 Mb，GC含量为46.43%，其中染色体大小为2.73 Mb，GC含量为46.51%；质粒大小为36.08 kb，GC含量为39.65%，共包含了2 694个蛋白质编码区。

本研究团队前期完成的副干酪乳酪杆菌PC-01的基因组测及序组装，发现基因组仅有1条染色体组成。

本研究发现副干酪乳酪杆菌基因组大小为（2.87±0.15）Mb；GC含量为46.31%±0.25%；包含了2 875.8±164.8个蛋白质编码区。

GTDB数据库使用相对进化差异来描述高等级的分类单元并划分物种集群、限定分类单元，因此该数据库可以实现基因组在物种水平的分类。

本研究使用GTDB数据库对Zhang的分类学地位进行确定，结果显示其为副干酪乳酪杆菌。

Zhang的GTDB数据库比对结果

ANI通过在全基因组学水平进行基因组的同源序列比对从而鉴定菌株的亲缘关系。

比较基因组学中，一般将ANI值大于95%视为同一物种。

结果显示近缘物种干酪乳酪杆菌ATCC 393T、鼠李糖乳酪杆菌DSM 20021T与334株副干酪乳酪杆菌的ANI值小于95%，333株副干酪乳酪杆菌之间ANI值均大于95%，表明其为同一物种。

Zhang与模式菌株ATCC 25302T的ANI值是98.49%，大于95%，说明Zhang与副干酪乳酪杆菌ATCC 25302T为同一物种。

上述结果表明，Zhang的分类学地位应为副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）。

系统发育树可直观反映菌株间群体结构和遗传进化关系。

为了分析Zhang与公共数据库中318株副干酪乳酪杆菌的系统发育关系，本研究以近缘物种干酪乳酪杆菌ATCC 393T和鼠李糖乳酪杆菌DSM 20021T作为外群，基于59个核心基因的核酸序列，通过邻接法构建系统发育树。

核心基因系统发育树分为3个大分支，分别为作为外群的干酪乳酪杆菌ATCC 393T、鼠李糖乳酪杆菌DSM 20021T以及333株副干酪乳酪杆菌，表明不同物种在核心基因系统发育树上具有较大差异。

此外，Zhang与模式菌株副干酪乳酪杆菌 ATCC 25302T聚集在同一大分支中，该结果支持Zhang为副干酪乳酪杆菌。

Zhang原始菌株与其第0，25，50，75，100代菌株聚集在同一小分支，与副干酪乳酪杆菌SCB0563的遗传距离较近。

对干酪乳酪杆菌ATCC 393T、鼠李糖乳酪杆菌DSM 20021T、副干酪乳酪杆菌ATCC 25302T和副干酪乳酪杆菌坚韧亚种DSM 20258T以及Zhang的335个核心基因的核酸序列，使用最大似然法（Maximum likelihood， ML）构建系统发育树。

副干酪乳酪杆菌ATCC 25302T、副干酪乳酪杆菌坚韧亚种DSM 20258T和Zhang聚集在同一进化枝上，再次验证了Zhang的分类学地位为副干酪乳酪杆菌。

但由于不同物种之间差异较大，因此无法判断Zhang亚种水平的分类学地位。

本研究团队前期通过比较16S rRNA、看家基因和核心基因的系统发育树，发现副干酪乳酪杆菌与亚种干酪乳酪杆菌ATCC 393T、鼠李糖乳酪杆菌DSM 20021T遗传差异较大，基于核心基因构建的系统发育树可以较好的区分干酪乳酪杆菌的近缘种。

由于外群菌株与333株副干酪乳酪杆菌之间的遗传距离较远，故进一步基于以副干酪乳酪杆菌ATCC 334的全基因组完成图序列作为参考基因组进行Core-SNP分析，并使用NJ法构建系统发育树。

SNP系统发育树分为3个大分支，Zhang原始菌株与其第0，25，50，75，100代菌株聚集在分支B的同一小分支，其相互之间略有差异，且与副干酪乳酪杆菌SCB0563的遗传距离较近。

以副干酪乳酪杆菌ATCC 334的全基因组完成图序列作为参考基因组，选取各分支选取代表菌株进行Core-SNP分析，并使用ML法构建系统发育树。

Zhang的分类学地位为副干酪乳酪杆菌，然而基于核心基因和Core-SNP都无法在副干酪乳酪杆菌的亚种水平上对其进行区分。

本研究团队前期发现不同代数15株菌所识别到的SNP位点均小于21个，表明干酪乳杆菌Zhang在MRS液体培养基中连续传代过程中有较好的遗传稳定性（已接收，未见刊）。

Fontana等研究发现副干酪乳酪杆菌群体在系统发育树中大致可划分为4个分支，与本研究系统发育树聚类结果一致。

综上所述，通过ANI、GTDB数据库注释、基于核心基因的系统发育分析和基于Core-SNP的系统发育分析结果一致，表明Zhang的分类学地位应为副干酪乳酪杆菌。

共线性可通过对同一物种不同个体基因组间同源序列及其排列顺序一致性的检测，来探究基因组间的相关性分析。

共线性分析结果显示，Zhang与ATCC 334基因组共线性良好。

然而，Zhang在其基因组328.49 kb位置处存在其49.37 kb处的特有片段，在Zhang基因组392.52 kb处存在PC-01没有的片段，而ATCC 334存在此片段。

Zhang在其基因组1.81 Mb位置处存在19.55 Kb的特有片段，包含酪氨酸蛋白激酶（yveL）和荚膜多糖生物合成蛋白质（ywqC）等基因。

Zhang基因组在511.30 kb处长度为311.29 kb的片段在PC-01的基因组中发生了基因组易位。

以上结果表明，Zhang和PC-01存在较大遗传差异。

有研究表明当一个基因刚好位于易位区域边缘时基因会被打断，促使基因内区、非翻译区域以及编码区域改变，导致DNA序列有较大的改变。

比较基因组学分析可对乳酸菌基因组所含有的耐药、致病性、环境抗性等相关基因的结构和功能信息进行分析，对乳酸菌在基因层面的安全性进行评估，一定程度上能有效地反映供试乳酸菌的生物安全性。

通过生物信息学分析发现，Zhang及其第0，25，50，75，100代菌株的基因组上均检测到了1种抗生素外排泵基因qacj，相似度为38.24%，小于40%，故认为不具有该耐药基因。

与此同时，并未在Zhang及其第0，25，50，75，100代菌株的基因组上检测到致病性基因和环境抗性基因。

综上，Zhang及其第0，25，50，75，100代菌株在基因组上不具有耐药基因、致病性基因和环境抗性基因。

细菌素是指细菌在代谢过程中合成并分泌的具有抗菌活性的物质，对其自身没有抑菌活性，而对亲缘关系较近的菌株具有抑制作用。

相关研究表明，可以通过基因挖掘工具发现新的细菌素基因簇。

通过细菌素基因簇注释，发现Zhang有2个潜在的热点区域（Areas of interest， AOI），以操纵子的结构排列。

AOI_01由36个开放阅读框（Open reading frames， ORFs）组成，包含Ⅱc细菌素相关核心肽LSEI_2386。

在基因簇的上游有天冬酰胺合成酶（LasC）及orf00005编码细菌素生成相关的乳酸脱氢酶。

下游位置的orf00045编码细菌素生成相关的乙酸激酶。

AOI_02由37个ORFs组成，核心肽包括Enterocin_X_chain_beta、Carnocin_CP52。

在基因簇的上游有ABC转运蛋白（LanT）及orf0007编码细菌素生成相关的组氨酸激酶，中游位置的orf00038编码免疫蛋白PlnI。

PlnI属于CAAX氨基蛋白酶家族，在其它细菌素基因簇中这种类CAAX基因十分罕见，目前其在细菌素合成过程中的作用尚不明确。

下游位置orf0007编码细菌素生成相关的氧化还原酶YdhF。

瞿茜楠等发现副干酪乳酪杆菌PC-724的细菌素基因簇含有细菌素Carnocin基因、专用免疫蛋白基因、ABC转运蛋白基因及其辅助蛋白基因，推测其可产生细菌素。

综上所述，推测Zhang可能具有产生细菌素Carnocin的潜力。

Zhang发现有15个潜在益生特性相关基因。

吕瑞瑞等在Zhang中注释到与糖基转移、转录调节等代谢功能相关基因（epsE、yybR、mshA）。

本研究还注释到了谷胱甘肽合成（gshAB）、核黄素合成（ribF、ribU）、黏附因子（atpC）、分泌胞外多糖（rmlA、rmlB、rmlD、epsE、epsJ、epsH）、耐酸基因（clpP）、提高宿主代谢能力（tagE）、乳酸和转运乳酸（pyk）产生相关的基因。

rmlA作为葡萄糖-1-磷酸胸苷酰基转移酶，能催化D-葡萄糖-1转化为dTDP-葡萄糖。

已有研究证明rmlA基因与细菌形态及耐受性相关。

据报道谷胱甘肽对于维持正常的免疫系统、整合解毒、抗氧化等方面都具有积极的影响。

此外谷胱甘肽也有助于菌株在胃肠道存活率的增加，利于菌株益生功能的发挥。

副干酪乳酪杆菌Zhang具有的潜在益生基因

本研究对Zhang进行比较基因组学分析发现，Zhang的分类学地位为副干酪乳酪杆菌。

Zhang在基因组上不含有耐药基因、致病性基因和环境抗性基因。

此外，Zhang携带核心肽、LanT转运和引导切割及免疫或运输功能的Carnocin相关细菌素基因簇，推测其可能具有产生细菌素Carnocin的潜力。

Zhang还携带谷胱甘肽合成（gshAB）、核黄素合成（ribF）、黏附因子（atpC）、耐酸基因（clpP）和分泌胞外多糖（rmlA、epsH）等潜在益生基因。

本研究明确了Zhang的分类学地位为副干酪乳酪杆菌，评估发现其在基因组上不具有耐药基因、致病性基因和环境抗性基因，并注释发现完整的细菌素基因簇及谷胱甘肽生物合成等潜在益生基因，为其进一步开发研究以及产业化提供了遗传学基础。